陆军军医大学张建祥教授团队：自发光型纳米粒的构建及其在炎症成像和肿瘤治疗中的应用研究

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炎症与包括肿瘤在内的众多疾病的发生发展息息相关。迅猛发展的纳米技术为炎症相关疾病的诊断和治疗提供了新的思路、方法和工具。其中，基于纳米探针的光学成像因其独特的灵敏性和非侵袭性受到越来越多研究者的青睐。而传统的光学成像纳米探针由于受到外界激发光穿透能力以及生物降解等因素的影响，其在基础研究领域和临床两方面的应用依然面临诸多挑战。

基于炎症局部活性氧（ROS）异常升高以及中性粒细胞浸润的特征，张建祥教授团队构建了集自发光成像与光动力治疗于一体的髓过氧化物酶（MPO）/ROS响应性纳米粒。具体思路为，将发光基团Luminol和亲水性聚乙二醇（PEG）共价键合于光敏剂Ce6，形成两亲性共聚物CLP，通过其自组装得到具有核-壳结构的纳米粒。在激活中性粒细胞分泌的MPO催化下，炎症局部富含的过氧化氢可生成具有超强氧化能力的次氯酸根，氧化Luminol发光，并可通过共振能量转移（BRET）激发Ce6产生近红外光。由于近红外光的组织穿透能力强于Luminol本身的自发光，适宜于深层组织成像，可有效运用于腹膜炎、急性肺损伤和结肠炎的成像诊断中。CLP纳米粒的自发光强度与结肠炎相关指标呈正相关，可用于炎症疾病发展进程的示踪研究。另一方面，激活的光敏剂Ce6还伴随有单线态氧的产生，可用于无需外界激发的原位光动力肿瘤治疗。可以预见，这种基于ROS响应性的自发光纳米系统可以为炎症性疾病的诊断和治疗提供强有力的工具。

图1. 自发光纳米粒的构造示意图及表征。（A）两亲性共聚物CLP的设计示意图；（B）两亲性共聚物CLP自组装成纳米粒的示意图；（C）紫外吸收图谱；（D）荧光图谱；（E）CLP纳米粒的透射电镜图及粒径分布图。

图2. 体外BRET效果验证及CLP纳米粒的自发光性能研究。(A)CLP，Ce6-PEG及Luminol的自发光图谱；（B）Luminol的自发光图谱和Ce6吸收图谱的重合情况；（C）双氧水浓度对CLP纳米粒自发光强度及发光持续时间的影响；（D，E）不同氧化条件对CLP纳米粒自发光强度的影响；（F，G）ROS清除剂Tempol及MPO抑制剂4-ABAH对CLP纳米粒自发光强度的抑制效果；（H）体外对比Luminol和CLP纳米粒的自发光穿透能力；（I）CLP纳米粒对活化及非活化中性粒细胞自发光成像活能力对比；（J）CLP纳米粒对活化中性粒细胞成像部位的考察。

图3. CLP纳米粒对小鼠炎症模型的体内自发光成像研究。(A)腹腔注射不同药物后，腹膜炎模型鼠自发光成像研究；（B）静脉注射不同药物后，腹膜炎模型鼠自发光成像研究；（C）静脉注射不同药物后，急性肝损伤模型鼠的自发光成像研究；（D）直肠灌注不同药物后，结肠炎模型鼠自发光成像研究；（E）离体结直肠体外自发光成像研究；（F）luminol及CLP纳米粒给药后，结肠炎模型鼠自发光成像持续时间研究.

图4. CLP纳米粒对结肠炎不同发展进程的体内自发光成像研究。(A，B)CLP纳米粒对不同发展程度结肠炎自发光成像及统计结果；（C-E）不同发展进程结肠炎小鼠的疾病指数，MPO水平及H2O2水平定量研究；（F，G）不同发展进程的结肠炎小鼠肠道组织中性粒细胞数目的流式分析及统计结果；（H）自发光成像结果与疾病相关指标的相关性研究；（I，J）不同发展进程的结肠炎小鼠的直肠组织H&E切片及组织学活性指数评分。

图5. CLP纳米粒体内外抗肿瘤活性研究。(A，B)CLP纳米粒剂量及H2O2浓度对单线态氧产量的影响；（C）A549细胞对CLP纳米粒内吞的时间依赖性；（D）不同细胞与CLP纳米粒共孵育24h后的IC50；（E）不同细胞与CLP纳米粒共孵育后胞内ROS变化；（F）IC50与ROS水平之间的相关性分析；（G-I）通过瘤内给药方式治疗时的肿瘤生长曲线及治疗第30天时的肿瘤照片，肿瘤重量的统计结果；（J，K）通过瘤内给药方式治疗30天后，肿瘤切片的TUNEL及PCNA染色；（L）瘤内给药方式治疗30天后肿瘤组织的ROS变化；（M）A549移植瘤小鼠尾静脉注射CLP纳米粒7天后，肿瘤离体荧光成像照片及统计结果；（N）通过尾静脉给药方式治疗时的肿瘤生长曲线；（O）通过尾静脉给药方式治疗30天后肿瘤切片的TUNEL染色。

图6. CLP纳米粒在A549细胞水平上的抗肿瘤机制研究。(A)CLP纳米粒和A549细胞线粒体共定位研究；（B，C）CLP纳米粒剂量与孵育时间对线粒体膜电位的影响；（D，E）A549细胞与CLP纳米粒孵育24h后，caspase-3及cleaved caspase-3含量的WB检测图及定量结果；(F)凋亡细胞百分数与cleaved caspase-3表达水平的相关性分析；（G，H）A549细胞与CLP纳米粒孵育24 h后，caspase-8以及caspase-9含量的WB检测图。（I）CLP纳米粒的抗肿瘤机制示意图。

该工作以A self-illuminating nanoparticle for inflammation imaging and cancer therapy为题发表在综合性刊物Science Advances上。论文的第一作者为博士生徐晓秋和安会杰，通讯作者为张建祥教授。

张建祥教授课题组长期从事炎症相关疾病的成像与靶向治疗研究，近两年的成果还先后发表于Journal of the American College of Cardiology, 2018, 72(21): 2591-2605; Advanced Science, 2018, 5(10): 1800781; ACS Nano, 2018, 12(9): 8943-8960; Materials Today, 2017, 20(9): 493-500;Biomaterials, 2017, 143: 93-108;Materials Today, 2017, 20(6): 301-313; Nano Letters, 2017, 17(2): 1056-1064.

论文链接：

http://advances.sciencemag.org/content/5/1/eaat2953

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